夾心法ELISA操作步驟

更新時(shí)間：2023-02-24

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操作步驟

分別設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)孔、0孔和樣本孔，計(jì)算好當(dāng)次試驗(yàn)所需要的板條數(shù)量，將不需要的板條拆卸下來(lái)，用新的封板膜重新封好，放回裝有干燥劑的鋁箔袋。

浸泡酶標(biāo)板：加入300 μL 1×洗滌液靜置浸泡30秒，棄掉洗滌液之后，在吸水紙上將微孔板拍干，重復(fù)2次。

提示：洗板完成之后，請(qǐng)立即使用微孔板，不要讓微孔板干燥。

加標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品孔加入100 μL的2倍倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品。0孔加入100 μL標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液。

加樣本：樣本孔加入100 μL的待測(cè)樣本。保證連續(xù)加樣，不要間斷。加樣過(guò)程在10 min內(nèi)完成。

孵育：使用新的封板膜封板。37℃靜置孵育90 min。

洗滌：棄掉液體，每孔加入300 μL洗液洗板，洗滌4次。每次洗板，在吸水紙上拍干。

提示：為獲得理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，必須干凈移除殘留液體。洗板完成之后，請(qǐng)立即進(jìn)行下步操作，不要讓微孔板干燥。

加生物素化檢測(cè)抗體：加入100 μL生物素化抗體工作液至反應(yīng)孔中。

孵育：使用新的封板膜封板。37℃靜置孵育60 min。

洗滌：棄掉液體，每孔加入300 μL洗液洗板，洗滌4次。每次洗板，在吸水紙上拍干。

提示：為獲得理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，必須干凈移除殘留液體。洗板完成之后，請(qǐng)立即進(jìn)行下步操作，不要讓微孔板干燥。

加酶結(jié)合物：加入100 μL酶結(jié)合物工作液至反應(yīng)孔中。

孵育：使用新的封板膜封板。封板后于37℃靜置孵育30 min。

洗滌：棄掉液體，每孔加入300 μL洗液洗板，洗滌5次。每次洗板，在吸水紙上拍干。

提示：為獲得理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，必須干凈移除殘留液體。洗板完成之后，請(qǐng)立即進(jìn)行下步操作，不要讓微孔板干燥。

加底物顯色：每孔加入100 μL顯色底物TMB，避光，37℃避光顯色15 min。

提示：可根據(jù)實(shí)際顯色情況酌情縮短或延長(zhǎng)顯色時(shí)間，但不可超過(guò)30 min。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔顏色出現(xiàn)明顯梯度時(shí)（標(biāo)準(zhǔn)孔的前4孔出現(xiàn)明顯的藍(lán)色梯度，后3~4孔不明顯），即可終止。提前15 min打開(kāi)酶標(biāo)儀預(yù)熱。

加終止液：每孔加入50 μL終止液，終止液加入的順序應(yīng)盡量與顯色底物加入的順序相同。

提示：終止液加入后微孔板內(nèi)液體的顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色。如果顏色呈現(xiàn)綠色或者顏色的變化明顯不均勻，請(qǐng)輕輕叩擊板框，水平充分混勻。

檢測(cè)讀數(shù)：在5 min之內(nèi)，使用酶標(biāo)儀進(jìn)行雙波長(zhǎng)檢測(cè)，測(cè)定450 nm最大吸收波長(zhǎng)和630 nm參考波長(zhǎng)下的OD值。

提示：校準(zhǔn)后的OD值為450 nm的測(cè)定值減去630 nm的測(cè)定值。（注：630 nm OD值為酶標(biāo)板材質(zhì)吸收值。若不能進(jìn)行雙波長(zhǎng)檢測(cè)，可只測(cè)定450 nm波長(zhǎng)下的OD值，但數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度會(huì)降低一些）

注意事項(xiàng)：

檢測(cè)之前請(qǐng)將所有的試劑、樣本平衡至室溫。

樣本復(fù)融后若有沉淀，需再次離心，取上清檢測(cè)。

試劑或樣本配制時(shí)，需充分混勻并盡量避免起泡。

標(biāo)曲和樣本建議做復(fù)孔檢測(cè)。

檢測(cè)實(shí)驗(yàn)操作前，準(zhǔn)備好所有需要的試劑及工作濃度的標(biāo)準(zhǔn)品。

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夾心法ELISA操作步驟